2017, Vol. 49
2. 城市水资源与水环境国家重点实验室(哈尔滨工业大学)，哈尔滨 150090
2. State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment (Harbin Institute of Technology), Harbin 150090, China
厌氧氨氧化工艺(anaerobic ammonium oxidation，ANAMMOX)
| $ \begin{array}{l} \;\;\;\;{\rm{NH}}_4^ + + 1.32{\rm{NO}}_2^ - + 0.066{\rm{HCO}}_3^ - + 0.13{{\rm{H}}^ + } \to \\ 1.02{{\rm{N}}_2} + 0.26{\rm{NO}}_3^ - + 0.066{\rm{C}}{{\rm{H}}_2}{{\rm{O}}_{0.5}}{{\rm{N}}_{0.15}} + 2.03{{\rm{H}}_2}{\rm{O}}, \end{array} $ |
由于具有能源消耗量低、无需外加有机碳源、污泥产量低等优点而成为当前研究的热点.厌氧氨氧化菌(AnAOB)生长速率缓慢[1]，因此，如何实现AnAOB的快速富集与有效持留菌体成为制约其工程应用的关键.颗粒污泥技术由于可以有效解决污泥流失的难题，而成为厌氧氨氧化研究应用的主要形式[2-5].而胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)是实现颗粒污泥快速形成与稳定维持的关键因素之一，其主要成分是胞外多糖(ploysaccharide，PS)和胞外蛋白(protein，PN).EPS的形成受水质条件、反应器运行方式、基质消耗速率以及优势菌种的代谢水平等多种因素影响[6]，同时，EPS也发生水解并在基质匮乏时充当碳源和能源物质被消耗[7]，因此，反应器内的EPS含量是产生与消耗的综合表征.目前，国内外对于EPS的研究主要集中于好氧颗粒污泥领域[8-12]，而针对厌氧氨氧化颗粒污泥这种厌氧自养菌形成的颗粒污泥的EPS研究较少，且主要侧重于EPS对于颗粒污泥快速形成的作用研究[13-17]，而关于水质条件对厌氧氨氧化颗粒污泥EPS含量的影响方面的研究较少.
本实验通过向16组完全相同的SBR反应器分别接种稳定运行的厌氧氨氧化颗粒污泥，研究同一周期内EPS变化以及不同总氮质量浓度、IC/TN、COD/TN对厌氧氨氧化颗粒污泥EPS含量的影响，以期进一步明晰水质条件对于厌氧氨氧化颗粒污泥EPS含量的影响，从而提出相应的控制条件，实现厌氧氨氧化颗粒污泥工艺的稳定运行，也为未来厌氧氨氧化颗粒污泥的数学建模提供数据基础.
1 实验 1.1 实验装置实验采用16个完全相同的SBR反应器，反应器由有机玻璃精加工而成，高18 cm，内径10 cm，有效容积1 L.利用六联搅拌机控制相同转速使各反应器内细菌与基质充分混合，搅拌机转速100 r/min.
1.2 接种污泥与实验水质接种污泥采用在氨氮质量浓度为45 mg/L、亚氮质量浓度为60 mg/L的人工配水水质条件下稳定运行的UASB反应器中的厌氧氨氧化颗粒污泥，反应器容积24 L，总氮去除率79%，总氮去除负荷1.35 kg/(m3·d)，颗粒污泥体积平均粒径2.12 mm.实验水质以(NH4)2SO4、NaNO2、KH2PO4为营养物质，NaHCO3为无机碳源，乙酸钠为有机碳源，温度为室温24~26 ℃.各反应器具体水质条件见表 1.
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表 1 各反应器水质条件对比 Table 1 Comparison of water quality of each reactor |
1#~16#反应器均采用SBR的运行方式，每个周期包括瞬时进水、反应(时间为T)、沉淀(1 min)、排水(1 min).各反应器的反应时间T按照氨氧化率达到90%确定.实验共计运行3个周期，每个周期运行前通过循环进水(自来水)-搅拌-沉淀-排水等过程，将上一个周期残留的NH4+-N、NO2--N、NO3--N、COD、IC等淘洗干净以排除干扰.为避免溶解氧对于厌氧氨氧化活性的抑制，每周期在加入基质前分别加入0.1 g亚硫酸钠以去除进水中的溶解氧至0.1 mg/L以下，反应器运行过程中封闭以避免溶解氧对于厌氧氨氧化菌活性的抑制.
为研究同周期厌氧氨氧化颗粒污泥EPS分泌量的变化(以3#反应器为例)，按基质是否反应完全划分为基质利用阶段与基质匮乏阶段，在0、5、10、20、40、60、80、100、125、150 min与210、270 min分别取泥水混合样来提取并测定EPS (PN、PS)含量以及氮化合物含量研究基质利用阶段.为比较不同水质条件对厌氧氨氧化污泥EPS分泌量的影响，在各反应周期刚刚结束未静置前取泥水混合样来提取并测定EPS (PS、PN)含量.
1.4 分析项目与方法DO、T、pH均采用WTW便携测定仪测定；MLVSS采用重量法测定；水样分析中NH4+-N采用纳氏试剂光度法测定，NO2--N采用N-(1-萘基)乙二胺光度法测定，NO3--N采用紫外分光光度法测定，TIC采用非色散红外吸收TOC测定仪，COD采用COD快速测定仪.EPS中多糖含量的测定采用苯酚-硫酸比色法，蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法.EPS的提取方法为首先取泥水混合样品于10 mL离心管中，室温下用离心机以8 000 r/min离心15 min，倒掉上清液，加入适量磷酸盐缓冲溶液，将污泥稀释至原体积，之后将污泥摇散后超声处理3.5 min，接着80 ℃水浴30 min (每隔10 min左右将泥摇匀1次)，最后用离心机8 000 r/min离心15 min，取上清液测定多糖、蛋白质含量，剩余污泥测定MLVSS.
实验涉及的公式如下:
| $ {R_{{\rm{AN}}}} = \frac{{{\rho _{{\rm{inf}}}}\left( {{\rm{NH}}_4^ + - {\rm{N}}} \right) - {\rho _{{\rm{eff}}}}\left( {{\rm{NH}}_4^ + - {\rm{N}}} \right)}}{{{\rm{HRT}} \times {\rho _{{\rm{MLVSS}}}}}}, $ | (1) |
| $ R = \frac{{{\rho _{inf}}({\rm{NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }} - {\rm{N) + }}{\rho _{{\rm{inf}}}}{\rm{(NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{ - N) + }}{\rho _{{\rm{inf}}}}{\rm{(NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}{\rm{ - N) - }}{\rho _{{\rm{eff}}}}{\rm{(NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}{\rm{ - N) - }}{\rho _{{\rm{eff}}}}{\rm{(NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{ - N) - }}{\rho _{{\rm{eff}}}}{\rm{(NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}{\rm{ - N)}}}}{{{\rho _{{\rm{inf}}}}{\rm{(NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}{\rm{ - N) + }}{\rho _{{\rm{inf}}}}{\rm{(NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{ - N) + }}{\rho _{{\rm{inf}}}}{\rm{(NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}{\rm{ - N)}}}}{\rm{, }} $ | (2) |
| $ {R_{{\rm{TN}}}}{\rm{ = }}\frac{{{\rho _{{\rm{inf}}}}{\rm{(NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}{\rm{ - N) + }}{\rho _{{\rm{inf}}}}{\rm{(NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{ - N) + }}{\rho _{{\rm{inf}}}}{\rm{(NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}{\rm{ - N) - }}{\rho _{{\rm{eff}}}}{\rm{(NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}{\rm{ - N) - }}{\rho _{{\rm{eff}}}}{\rm{(NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{ - N) - }}{\rho _{{\rm{eff}}}}{\rm{(NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}{\rm{ - N) }}}}{{{\rm{HRT}}}}{\rm{.}} $ | (3) |
式中：RAN为平均厌氧氨氧化活性，R为总氮去除率，RTN为总氮去除负荷，ρinf(NH4+-N)、ρeff(NH4+-N)为进水、出水氨氮质量浓度，ρinf(NO2--N)、ρeff(NO2--N)为进水、出水亚氮质量浓度，ρinf(NO3--N)、ρeff(NO3--N)为进水、出水硝氮质量浓度，mg/L.HRT为水力停留时间，min.ρMLVSS为混合液挥发性悬浮固体质量浓度，g/L.平均厌氧氨氧化活性(RAN)指单位质量厌氧氨氧化菌在一个反应周期内的平均氨氮氧化速率，其大小直接影响厌氧氨氧化反应器宏观脱氮效果.
2 结果与讨论 2.1 不同反应时期厌氧氨氧化颗粒污泥EPS含量的变化以3#反应器为典型，研究同周期内不同反应时期的厌氧氨氧化颗粒污泥EPS含量的变化.反应器内的基质质量浓度与EPS总量变化如图 1所示.在0~150 min内，氨氮与亚硝酸盐氮质量浓度不断下降，反应器总氮去除率为87%，总氮去除负荷为1.12 g/(L·d).反应器内的PS与PN的变化如图 2所示.在反应周期内，EPS各组分质量分数不断升高，单位MLVSS PS质量分数由开始时的34.28 mg/g不断升高至结束时的37.81 mg/g；PN质量分数由开始时的89.35 mg/g不断升高至结束时的94.01 mg/g；EPS总量由开始时的123.63 mg/g升高至结束时的131.82 mg/g.在整个反应周期内，厌氧氨氧化菌具有充足的基质来维持较高的厌氧氨氧化活性，因此，细菌产生的EPS也因不断积累而升高.研究表明EPS具有促进细胞絮凝、维持颗粒结构以及提供能源等多种作用[19]，不断增加的EPS将有助于促进污泥颗粒化同时维持颗粒结构的稳定.由表 2可知，厌氧氨氧化污泥的EPS总量明显高于其他种类污泥，较高的EPS含量使得厌氧氨氧化污泥更易于发生细胞凝聚而形成颗粒.研究表明，厌氧氨氧化污泥高度的凝聚性不仅意味着细胞数量的增加，细胞间的信息交换和合作也都将加强，继而增强细胞的代谢和活性，EPS对于细胞凝聚的促进作用将增加基因表达的稳健性，增强厌氧氨氧化菌对于客观环境变化的容忍性[13].厌氧氨氧化污泥EPS中的PN组分比例明显高于其他种类污泥，而Hou等[13]通过絮凝实验证实了PN是影响厌氧氨氧化菌凝聚性的关键物质，因此，厌氧氨氧化污泥EPS中较高的PN含量将有助于厌氧氨氧化菌的细胞凝聚形成颗粒.
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图 1 同周期内基质质量浓度与EPS总量变化 Figure 1 Changes of matrix concentration and total amount of EPS in the same cycle |
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图 2 同周期内胞外多糖与蛋白质质量分数变化 Figure 2 Changes of polysaccharide and protein content in the same cycle |
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表 2 不同种类污泥EPS各组分对比 Table 2 Comparison of contents of EPS in different kinds of sludge |
为研究基质匮乏状态下厌氧氨氧化菌EPS含量的变化，反应器继续运行2 h，PS质量分数逐步下降至35.23 mg/g，PN逐步下降至90.22 mg/g，EPS总量下降至125.45 mg/g.在周期结束后的150~270 min，EPS的形成过程由于基质匮乏而停滞，但是部分EPS依然通过水解等作用释放到液相中且部分可生物降解的EPS又被充当能源物质而消耗，以维持细菌的正常代谢.吴昌永等[11]通过厌氧/好氧交替的运行方式研究了好氧颗粒污泥在基质利用阶段与基质匮乏阶段EPS的变化，结果也表明基质利用阶段储存的EPS在基质匮乏阶段可以被利用，从而保证了EPS含量的稳定而更有利于促进颗粒的形成；李冬等[20]研究了亚硝化污泥在一个典型周期内EPS含量的变化，结果表明PN和PS均呈逐渐增加趋势，而在基质匮乏阶段，PN和PS又被当做能源物质而消耗，这些现象与本研究的厌氧氨氧化污泥EPS含量在基质匮乏阶段的变化趋势相同.由于EPS在基质利用阶段不断升高而又在基质匮乏阶段不断下降，SBR工艺所具有的间歇进料特性将有利于维持反应器内EPS含量的稳定，避免由于EPS持续升高而导致基质传递通道受阻继而降低微生物活性的问题；但是基质匮乏阶段较长也会造成EPS含量大幅下降，造成颗粒解体继而影响污泥颗粒化.因此，SBR工艺在实际控制过程中应避免过长的反应阶段以及闲置阶段，因不利于反应器脱氮性能的发挥以及颗粒结构的稳定.
2.2 总氮质量浓度对厌氧氨氧化颗粒污泥EPS含量的影响为研究总氮质量浓度对于厌氧氨氧化颗粒污泥EPS含量的影响，采用1#~6#反应器进行对比，结果如图 3、4所示.总氮质量浓度在35~210 mg/L时，PS质量分数由35.23 mg/g升高至38.92 mg/g，继续增加总氮质量浓度至350 mg/L时，PS质量分数下降至36.54 mg/g；总氮质量浓度在35~280 mg/L时，PN质量分数由90.46 mg/g升高至96.81 mg/g，继续增加总氮质量浓度至350 mg/L时，PN质量分数下降至95.34 mg/g；总氮质量浓度在35~280 mg/L时，EPS总量由125.69 mg/g升高至134.5 mg/g，继续增加总氮质量浓度至350 mg/L时，EPS总量下降至131.88 mg/g.综上，总氮质量浓度在一定范围内时，EPS及各组分含量随着基质质量浓度的升高而升高，超过一定范围，继续提高总氮质量浓度反而会使EPS及各组分含量降低.当总氮质量浓度较低时，提高总氮质量浓度意味着基质消耗速率的提高，而研究表明EPS的形成速率与基质消耗速率呈比例关系，同时反应时间的延长也将使基质利用阶段产生的EPS增多；但是基质质量浓度较高时，过长的反应时间将使得EPS的含量过高，易堵塞基质向颗粒内部传递的通道，而且EPS黏性较强也会增加基质向颗粒内部传递的阻力[23]，降低微生物活性，且研究表明过高的亚氮质量浓度也会对厌氧氨氧化菌的活性造成抑制，微生物活性降低反过来也会导致EPS的形成量降低，不利于颗粒污泥的形成与结构稳定性的维持.李冬等[20]对亚硝化污泥EPS含量的研究结果也进一步证实了过高的基质质量浓度不利于EPS的分泌.综上，总氮质量浓度过高不利于EPS含量的提高，也不利于厌氧氨氧化活性的充分发挥.实验中，总氮质量浓度在35~150 mg/L时，RAN由92.82 mg/(g·d)不断升高至110.95 mg/(g·d)，继续提高总氮质量浓度至350 mg/L时，RAN不断下降至67.95 mg/(g·d).由图 2可知，在实际工艺运行过程中，通过调节容积交换率的方式控制反应初期的总氮质量浓度在150~210 mg/L时，既可以实现较高微生物活性及反应器的脱氮性能，还可以形成较高的EPS含量促进污泥颗粒化以及结构稳定性.
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图 3 总氮质量浓度对厌氧氨氧化活性与EPS总量的影响 Figure 3 Effects of total nitrogen concentration on anaerobic ammonia oxidation activity and total amount of EPS |
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图 4 总氮质量浓度对胞外多糖与蛋白质质量分数的影响 Figure 4 Effects of total nitrogen concentration on extracellular polysaccharide and protein content |
为研究无机碳对于厌氧氨氧化菌EPS含量的影响，采用3#、7#~11#反应器进行对比，结果如图 5、6所示.
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图 5 无机碳对厌氧氨氧化活性与EPS总量的影响 Figure 5 Effects of inorganic carbon on anaerobic ammonia oxidation activity and total amount of EPS |
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图 6 无机碳对胞外多糖与蛋白质质量分数的影响 Figure 6 Effects of inorganic carbon on extracellular polysaccharide and protein content |
IC/TN在0.01~0.2时，PS质量分数由34.34 mg/g不断升高至38.23 mg/g，PN质量分数由90.34 mg/g不断升高至95.12 mg/g，EPS总量由124.31 mg/g不断升高至133.35 mg/g；继续增加无机碳至IC/TN为0.5时，EPS及各组分含量并无明显增长.综上，无机碳质量浓度在一定范围内时，EPS及各组分含量随着无机碳质量浓度的升高而升高，超过一定范围，继续提高无机碳质量浓度对于EPS及各组分含量无明显影响.无机碳作为厌氧氨氧化菌的碳源，影响厌氧氨氧化菌的活性以及EPS的分泌量，理论上厌氧氨氧化反应需要的无机碳含量为IC/TN=0.024(按反应式(1)计算)，本实验在IC/TN为0.01~0.2时，RAN由70.05 mg/(g·d)不断升高至116.19 mg/(g·d)，表明无机碳对于厌氧氨氧化活性具有显著的促进作用，相关研究结果也进一步证明了无机碳对于厌氧氨氧化菌活性具有促进作用[24-25]，无机碳对于厌氧氨氧化活性的促进作用将导致厌氧氨氧化菌EPS分泌量的提高，但是无机碳的促进作用有一定限制，当IC/TN>0.2时，无机碳无法继续提高厌氧氨氧化菌活性及EPS含量.综合EPS含量与微生物活性两方面影响，厌氧氨氧化颗粒污泥工艺的无机碳质量浓度应控制在IC/TN为0.1~0.2，在厌氧氨氧化颗粒污泥工艺的实际运行过程中，若无机碳源质量浓度较低，应当投加适量无机碳源，以避免由于无机碳的缺乏造成EPS含量的降低以及微生物活性的限制.
2.4 有机物对于厌氧氨氧化污泥活性及EPS含量的影响已有研究表明，有机物的存在对于厌氧氨氧化菌活性以及EPS含量有重要影响.为研究有机物质量浓度对于厌氧氨氧化菌EPS含量的影响，采用3#、12#~16#反应器进行对比，结果如图 7、8所示.COD/TN为0时，PS和PN质量分数分别为37.81和94.01 mg/g，RAN为110.945 mg/(g·d)；提高有机物至COD/TN=0.5时，PS和PN质量分数分别升高至38.63和94.56 mg/g，RAN也升高至119.98 mg/(g·d)；继续提高有机物至COD/TN=2.5时，PS和PN质量分数分别下降至35.01和91.56 mg/g，RAN也下降至71.16 mg/(g·d)；EPS总量的变化趋势与PS和PN的变化趋势相同.由此表明，少量有机物的存在可以促进厌氧氨氧化菌活性同时提高EPS的含量，继续提高有机物质量浓度将抑制厌氧氨氧化的活性并且降低厌氧氨氧化菌EPS及各组分的含量.Ni等[15]的研究结果表明即使进水中不含有机物的厌氧氨氧化系统中也将含有23%的异养菌，这些异养菌以可溶性的细胞产物、细菌腐败产物等为基质进行反应，有利于提高厌氧氨氧化系统的处理效果.Li等[14]的研究结果表明适量的COD有助于促进EPS的分泌从而促进污泥颗粒化，而过量的COD将抑制厌氧氨氧化菌的竞争优势.因此，少量有机物的存在将有利于异养菌分泌更多的EPS，但是由于厌氧氨氧化菌是自养菌，过高的有机物将对自养菌的生长代谢造成抑制，更不利于厌氧氨氧化菌EPS的分泌，因此，COD/N较高时，厌氧氨氧化活性和EPS及各组分含量均明显下降.李延军等[9]研究了COD/N对好氧颗粒污泥EPS含量的影响，结果表明多糖含量几乎没有变化，而蛋白质及EPS总量均随CON/N的增大而降低.陈晨等[22]研究了COD/N对厌氧颗粒污泥EPS的影响，结果表明EPS及各组分含量均随COD/N的增大而先增大后减少.李冬等[20]研究了有机物对于亚硝化污泥EPS含量的影响，结果显示废水中含有机物的污泥系统中EPS含量明显高于相同氨氮质量浓度、不含有机物质的污泥系统.综上，合适的COD/N对于细菌分泌EPS具有重要影响，对于厌氧氨氧化颗粒污泥工艺，实际运行过程中应控制COD/TN < 0.5，以避免有机物过高对于厌氧氨氧化活性的限制.
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图 7 有机物对厌氧氨氧化活性与EPS总量的影响 Figure 7 Effects of organic matter on anaerobic ammonia oxidation activity and total amount of EPS |
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图 8 有机物对胞外多糖与蛋白质质量分数的影响 Figure 8 Effects of organic matter on extracellular polysaccharide and protein content |
1) 同周期内，基质利用阶段的EPS及各组分含量不断增加；而基质匮乏阶段EPS及各组分含量又不断降低.在SBR工艺的实际控制过程中，应避免过长的基质利用阶段以及过长的基质匮乏阶段.
2) 总氮质量浓度为35~280 mg/L时，提高总氮质量浓度可以提高EPS的含量；总氮质量浓度超过280 mg/L时，提高总氮质量浓度会降低EPS及各组分含量.为维持较高的脱氮性能，总氮质量浓度应控制在150~210 mg/L.
3) IC/TN为0.01~0.2时，EPS及其各组分含量随无机碳质量浓度的升高而增加；IC/TN超过0.2时，无机碳质量浓度对于EPS及其各组分含量无明显影响；IC/TN应控制在0.1~0.5.
4) COD/TN < 0.5时，有机物对于EPS含量以及反应器脱氮性能具有促进作用；COD/TN超过0.5时，有机物的提高对于EPS含量以及反应器脱氮性能有抑制作用.COD/TN应控制在0.5以下.
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