2020, Vol. 52
2. 江苏省厌氧生物技术重点实验室(江南大学)，江苏 无锡 214122;
3. 江苏省高校水处理技术与材料协同创新中心，江苏 苏州 215009
2. Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology(Jiangnan University), Wuxi 214122, Jiangsu, China;
3. Collaborative Innovation Center of Water Treatment Technology and Material of Jiangsu Colleges, Suzhou 215009, Jiangsu, China
好氧颗粒污泥(AGS)技术作为一种新型的污水处理方法，在小试和中式装置中已被广泛研究，部分地区尝试将该技术应用于工业印染废水、含核废料废水的处理中，目前已取得显著成果[1-3].胞外聚合物(EPS)是AGS的重要组成部分，由微生物生长代谢的分泌物、细胞裂解产物和吸附的小分子化合物组成，成分复杂，主要特征物质包括蛋白质(protein, PN)和多糖(polysaccharide, PS)类以及少量的腐殖酸、富里酸和核酸类物质[4-5]，具有良好的絮凝性，Nielsen等[6]证明了EPS是促进AGS形成并提高AGS稳定性的关键因素.
按照组分和形态的不同，EPS可分为松散型胞外聚合物(soluble microbial products-EPS, SMP-EPS)、附着型胞外聚合物(loosely bound-EPS, LB-EPS)和紧密结合型胞外聚合物(tightly bound-EPS, TB-EPS)[7].Liao等[8]研究发现，EPS的组分和质量分数会对微生物絮凝、污泥沉降性和脱水性产生影响.TB-EPS中蛋白质质量分数增加会促进AGS的形成，LB-EPS中的某些蛋白质会影响污泥的电负性和脱水性[9].Tay等[10]认为TB-EPS中β-多糖可提高微生物间的黏附力，强化AGS结构稳定性.Adav等也发现不溶性多糖是AGS的支撑结构，可保证AGS具有较高的强度[1].相反，Liu等[7]认为污泥中的非细胞蛋白质核心为AGS稳定运行提供了骨架结构.因此，深入解析EPS不同组分的功能作用，有助于推动AGS技术的发展.目前，国内外针对EPS在AGS形成与稳定过程中的作用研究已经较多，但缺乏对EPS中功能组分和特性变化的详尽解析，限制了AGS技术的发展.
本文以接种污泥、实验室培养的好氧颗粒污泥(AGS-laboratory, AGS-LAB)和污水处理厂培养的好氧颗粒污泥(AGS-wastewater treatment plant, AGS-WWTP)为研究对象，通过傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)和三维荧光光谱(excitation-emission-matrix spectra, 3D-EEM)等技术对AGS形成过程中污泥EPS的组成成分和特性进行相关分析，旨在研究污泥颗粒化过程中EPS不同组分的变化特征，以期为AGS技术的发展和应用提供理论支撑.
1 实验 1.1 实验装置实验室和污水处理厂实验反应装置均采用有机玻璃制成的圆柱形SBR，前者高100 cm，内径8 cm，有效容积约为4 L；后者高60 cm，内径30 cm，有效容积约为42 L.反应器底部均装有曝气系统，曝气量大小由转子流量计控制，充氧期间溶解氧控制在5~8 mg/L.运行周期4 h，其中进水60 min、曝气时间由145 min逐渐增加到170 min，沉降时间由30 min逐渐降低到5 min.污泥泥龄20 d.
1.2 接种污泥与进水水质接种污泥取自无锡市某污水处理厂好氧池活性污泥，外表呈黄褐色，较为松散.实验室运行反应器进水采用人工配水，以CH3COONa为碳源，NH4Cl为氮源，K2HPO4为磷源，单位MLSS进水污泥COD负荷为0.39 kg/(kg · d).此外，还添加了少量的微量元素，以保证细菌正常的生长代谢活动.污水处理厂运行反应器进水为旋流沉砂池出水，大部分为生活污水，含有少量工业废水，进水污泥负荷平均为0.18 kg/(kg · d)，水质波动较大.
1.3 分析方法 1.3.1 胞外聚合物和生物量的测定EPS的提取采用NaOH法[11]，首先将10 mL待测样品置于50 mL离心管中，超声解体，分别在2 000，5 000和10 000 r/min的转速下离心15 min，收集上清液，即为SMP-EPS、LB-EPS和TB-EPS.用考马斯亮蓝法和蒽酮-硫酸比色法对EPS中蛋白质和多糖质量分数进行测定[9].
1.3.2 FTIR特性分析[12]采用IRTrace-100型傅里叶变换红外光谱仪(IRTrace，日本岛津)对样品进行官能团鉴定.具体操作方法如下：首先将污泥EPS样品置于LABCONCO冻干机上进行冻干处理，将处理好的样品粉末和KBr以合适的比例混合后在研磨机上研磨，使用压片机压片并用红外光谱仪进行光谱扫描.
1.3.3 三维荧光特性分析[13]首先将待测样品置于岛津总有机碳分析仪上检测DOC质量浓度，若DOC质量浓度太高，可用去离子水稀释直到DOC质量浓度低于10 mg/L，采用日立F7000荧光分光光度计进行三维荧光(日立F7000，日本日立)测试.本实验以10 nm为增量，激发波长从200 nm扫描至400 nm，发射波长从280 nm扫描至500 nm，扫描速度为12 000 nm/min.
1.3.4 水解氨基酸测试方法取污泥EPS样品约1 mL，先加入1 mL浓盐酸，再加7 mL的HCl溶液(6 mol/L)，充氮气后封管，在烘箱内120 ℃水解22 h；再加入4.8 mL的NaOH溶液(10 mol/L)中和，在25 mL容量瓶中定容，用滤纸过滤、离心；取400 μL澄清样品置于样品瓶，最后通过Agilent1260高效液相色谱仪(Agilent1260，美国)测定.
1.3.5 GC-MS分析[14]气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)(QP2010Ultra，日本岛津)可对有机物进行定性和定量分析.通过HCl和NaOH溶液调节样品的pH，分别对EPS中的中性、酸性和碱性有机物进行萃取，最后通过QP2010Ultra GC-MS对有机物鉴定.
2 结果与讨论 2.1 EPS变化 2.1.1 EPS组分变化特征具有黏附特性的EPS可促进微生物絮凝，缩短污泥颗粒化进程，并提高AGS结构稳定性[15].此外，蛋白质和多糖比例(PN与PS比)变化会影响污泥表面的亲疏水性、带电性和微生物群落结构的完整性[16].AGS-LAB中EPS的变化如图 1(a)所示，在接种污泥颗粒化过程中，EPS迅速增长，由接种污泥的84.36 mg/g增加到AGS-LAB的106.47 mg/g，以蛋白质增加为主，表明蛋白质在污泥颗粒化过程中发挥重要作用.AGS-LAB的EPS中多糖维持在18.8 mg/g左右，变化较小；PN与PS比呈现逐步上升的趋势，由接种污泥的4.27上升到AGS-LAB的6.65，PN与PS比的增加表明AGS-LAB中EPS疏水性提高，相应污泥表面的Gibbs自由能下降[17]，污泥之间的黏附性提高，有利于保持AGS紧密的内部结构.
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图 1 污泥颗粒化过程中胞外聚合物质量分数变化 Fig. 1 Variations of EPS contents during granulation |
AGS-WWTP的EPS变化如图 1(b)所示，EPS呈现先上升后下降的趋势，反应器运行至30 d时, 单位MLVSS EPS质量分数达到最大153.22 mg/g，60 d时下降到128.23 mg/g，而EPS的变化以蛋白质为主.通过水质监测发现，反应器运行至30 d时污水处理厂工业废水受纳增多，该水质对AGS-WWTP冲击较大，污泥微生物为提高自身稳定性，会分泌大量蛋白质抵抗外界不良环境，这是该阶段蛋白质质量分数较高的原因之一[18].当进水恢复稳定后，污泥微生物对蛋白质的需求下降，因此, 蛋白质的合成量降低.EPS中多糖质量分数变化较小，基本维持在15.9 mg/g，与图 1(a)中多糖变化相似，该现象与Zhu等[17]研究一致，这是因为多糖中含有羧基等亲水性带负电荷基团，该物质质量分数适中时，可吸附水中游离的微小絮体，促进AGS的形成，质量分数过高则容易影响污泥絮体的稳定性，导致AGS解体，因此, EPS中的多糖在相对稳定的范围内波动.AGS-WWTP在颗粒化过程中PN与PS比也呈现逐步上升的趋势，由接种污泥的4.27上升到AGS的7.54，略高于图 1(a)中AGS-LAB的6.65，推测与污水处理厂进水水质复杂有关.
2.1.2 EPS黏附性分级组分特征AGS-LAB中各层蛋白质和多糖的变化如图 2(a), (b)所示，蛋白质以TB-EPS层增加为主，由接种污泥的50.46 mg/g增加到AGS-LAB的83.14 mg/g，SMP-EPS和LB-EPS层蛋白质增量较小.SMP-EPS和LB-EPS层蛋白质位于微生物体的外侧，结构比较疏松，含水率较高，具有流变特性[19]，其质量分数较高容易导致AGS絮体化，使SVI值增大，进而导致AGS解体.TB-EPS层蛋白质分子排列密集，与细胞结合最紧密，可中和污泥中带负电荷的官能团，降低污泥的电负性，促进AGS的形成[20].多糖以SMP-EPS和TB-EPS层变化为主，SMP-EPS层多糖由接种污泥的3.04 mg/g增加到AGS-LAB的7.02 mg/g，该层多糖可通过离子键使细胞发生絮凝[21]，促进微生物聚集体的形成.TB-EPS层多糖由7.4 mg/g上升到10.2 mg/g，Chen等[22]研究发现，TB-EPS中β-多糖是构成AGS结构的骨架，该物质质量分数的升高可为AGS的稳定运行奠定基础.
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图 2 污泥颗粒化过程各层蛋白质和多糖的变化 Fig. 2 Variations of proteins and polysaccharides during granulation |
AGS-WWTP中各层蛋白质和多糖的变化如图 2(c), (d)所示，蛋白质以TB-EPS层增加为主，由接种污泥的50.46 mg/g增加到AGS-WWTP的103 mg/g，其增量大于AGS-LAB.SMP-EPS中蛋白质质量分数变化与图 2(a)中相似，LB-EPS中蛋白质质量分数略有下降，可能与进水水质有关.图 2(d)中多糖的变化与图 2(b)中具有很大差异，SMP-EPS和LB-EPS中多糖质量分数皆呈递减状态，这与进水中有机物匮乏有关，处于易脱落位置的SMP-EPS和LB-EPS中多糖被AGS-WWTP作为碳源利用.TB-EPS层多糖总体呈现上升趋势，有研究发现，TB-EPS中多糖质量分数的增加可提高污泥的抗冲击负荷和抗毒性冲击能力，该变化可以很好地适应污水处理厂的进水水质[23].
2.2 FTIR光谱分析接种污泥、AGS-LAB和AGS-WWTP胞外聚合物的FTIR见图 3.可以看出，AGS-LAB和AGS-WWTP存在类似特征峰：3 280~3 420 cm-1吸收峰属于羧酸、糖类等物质中羟基的伸缩振动，由于羧酸分子内氢键的作用使得该吸收峰峰型较为平滑[24].2 929 cm-1吸收峰是由芳香族氨基酸(色氨酸和苯丙氨酸)中—CH2伸缩振动引起的[25]，AGS中该峰的强度明显高于接种污泥，说明芳香族氨基酸在AGS中的质量分数较高.2 850 cm-1吸收峰与脂肪族中—OCH3的伸缩振动相关，AGS-LAB中2 859 cm-1吸收峰是该峰红移的结果，这是由于配水水质较为单一，某些官能团中取代基的电性发生了变化[26].1 654 cm-1表征蛋白质二级结构中双键对称伸缩振动引起的β-折叠和α-螺旋[27-28]，蛋白质的二级结构可促进生物絮凝，缩短接种污泥颗粒化进程.1 627 cm-1的吸收峰归属于无规卷曲结构，只存在于接种污泥中，表明其细胞黏附和聚集能力较弱.酪氨酸侧链酚类物质的环振动引起的1 517 cm-1特征吸收峰只存在于AGS中，推测酪氨酸蛋白是AGS形成的重要结构性蛋白质[28-29].AGS中位于1 420 cm-1特征吸收峰与天冬氨酸去质子化羧基中C O对称伸缩振动有关，Badireddy等[30]研究发现天冬氨酸蛋白在维持AGS结构稳定性方面发挥重要作用，表明实验室配水与污水处理厂进水培养的AGS均具有稳定结构.1 040 cm-1左右的吸收峰属于多糖中C—O、C—C伸缩振动和C—O—C、C—O—H变形振动，AGS中该峰强度较高，说明EPS中多糖在污泥颗粒化过程中也具有一定作用[25].
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图 3 接种污泥和好氧颗粒污泥中EPS的3D-EEM图谱 Fig. 3 3D-EEM spectra of EPS in seed sludge and AGS |
接种污泥、AGS-LAB和AGS-WWTP中SMP-EPS、LB-EPS和TB-EPS的三维荧光光谱如图 4所示，每个污泥样品中都存在4个峰，其中峰A(λEx/λEm=220~250/280~330)和峰B(λEx/λEm=220~250/330~380)分别为芳香族蛋白类物质和酪氨酸/色氨酸类蛋白；峰C(λEx/λEm=280~310/380~455)为类富里酸；峰D(λEx/λEm=300~330/360~390)为多糖区.由图 4(a), (d)和(g)可知，AGS中峰A和峰B的荧光强度皆高于接种污泥，说明在接种污泥颗粒化过程中SMP-EPS中蛋白质的增长主要以芳香族蛋白质类物质和酪氨酸/色氨酸类蛋白质为主，Dong等[31]推测酪氨酸蛋白是AGS的重要结构组分，会促进接种污泥颗粒化.此外，色氨酸类蛋白与EPS中的芳环氨基酸结构有关[32]，是一种疏水性物质，可提高AGS结构的稳定性，这与2.2傅里叶红外中2 929 cm-1吸收峰的变化具有良好对应关系.由图 4(b)、(e)和(h)中可知，3种污泥样品都存在芳香族蛋白类物质(峰A)，唯有AGS-LAB存在酪氨酸/色氨酸类蛋白(峰B)，这可能是因为污水处理厂进水水质复杂，对污泥中微生物群落的冲击较大，某些有毒有害物质抑制了细菌的代谢活动，造成相关蛋白质的合成量降低，此结果也与图 2(c)中测得LB-EPS蛋白质质量分数下降相符.由图 4(c), (f)和(i)可知，3种污泥样品TB-EPS中都存在峰B、峰C和峰D，只是峰的强度存在差异.其中，类富里酸(峰C)在接种污泥和AGS-WWTP中强度较低，这与进水水质复杂存在一定关系[33].TB-EPS中多糖区物质主要是指β-多糖，接种污泥和AGS-WWTP中多糖质量分数较低的原因可能与微生物群落结构存在差异有关[34].
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(a)~(c)接种污泥；(d)~(f)AGS-LAB; (g)~(i)AGS-WWTP; (a), (d), (g)SMP-EPS；(b), (e), (h)LB-EPS; (c), (f), (i)TB-EPS 图 4 接种污泥和好氧颗粒污泥中EPS的3D-EEM图谱 Fig. 4 3D-EEM spectra of EPS in seed sludge and AGS |
EPS中水解氨基酸的种类和质量分数可以反映污泥的理化性质和稳定性[35].Miller等[36]认为某些氨基酸能够影响细胞内基因的表达和多肽类物质的合成.Anfora[37]研究发现大部分功能性细菌可以合成右旋类氨基酸，该物质可以发挥信号分子的作用调节微生物群体行为，进而促进絮状污泥颗粒化并维持AGS结构稳定.由表 1可知，亲水性氨基酸如丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸和半胱氨酸在污泥样品中的质量分数均较低，这有利于促进AGS的形成.AGS-LAB中半胱氨酸的质量分数为6.18 mg/g，略高于另外两种污泥样品，Liao等[8]发现，通过二硫键连接的半胱氨酸分子，在某些部位适当提高其质量分数会加强蛋白质结构的稳定性.丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸属于疏水性氨基酸，其质量分数在AGS样品中相对较高，EPS疏水性的提高可增强污泥微生物间的黏附力，为絮状污泥的颗粒化提供物质基础[38].此外，组氨酸、精氨酸和赖氨酸在AGS-LAB和AGS-WWTP中分别升高56.88%和137.68%、17.09%和67.4%以及60.88%和20.23%.这3种物质属于碱性氨基酸，带有正电荷，可降低细胞表面负电荷，减少微生物间静电斥力，加强污泥表面的疏水性以及保持AGS的结构完整性[39].同时，氨基酸总量由接种污泥的177.16 mg/g分别升高到AGS-LAB和AGS-WWTP的218.64和235.98 mg/g，氨基酸总量的升高也为AGS的形成奠定物质基础.
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表 1 EPS中水解氨基酸质量分数和种类分析 Tab. 1 Analysis of contents and species of hydrolyzed amino acids in EPS |
针对外界条件的变化，微生物会利用群体感应进行信息交流，通过促进或抑制某些物质的合成以适应环境的变化[40].由于3种污泥样品所处环境不同，EPS中有机组分存在差异.通过GC-MS对其成分进行鉴定，并对样品中的共有物质和特有物质进行分析，结果如表 2所示.3种样品中存在6种相同的有机物组分，其中α-D-喃葡萄糖可吸附水中游离小分子物质，促进微生物聚集体的形成.油酸酰胺具有润滑剂的功能，可有效降低细胞间的黏附力，故AGS的EPS中该物质质量分数明显降低[41].苯甲醛属于芳香族化合物，醛基上的C O双键与苯环上的π键易形成共轭双键，可吸附水中的金属离子，降低污泥表面电负性，提高AGS的稳定性[42].分子量大、结构复杂的烷烃类和多环芳香族类化合物可为游离小分子物质提供结合位点.组氨酸作为蛋白质的重要组成成分，对污泥颗粒化过程发挥重要作用[43].3种污泥样品中存在8种特有物质，其中聚丙烯酸在接种污泥中质量分数较高，AGS中几乎不存在，主要是因为该物质会降低污泥黏度系数，阻碍微生物聚集[44].AGS中存在4种相同的有机组分：苯丙胺、羟基脲、二乙烯苯和十六甲基环八硅氧烷.其中，二乙烯苯是一种高分子交联剂，可为有机物的附着提供结合位点，提高AGS的强度.十六甲基环八硅氧烷是一种疏水性长链有机物，可以为菌胶团的形成提供载体，加快接种污泥的颗粒化进程[41].此外，苯甲酸，十六碳酰胺和2, 4-二叔丁基苯酚只存在于接种污泥和AGS-WWTP中，推测这与进水水质有关.苯甲酸是印染行业常用的一种染色剂，十六碳酰胺是沐浴露和化妆品的主要成分，2, 4-二叔丁基苯酚是橡胶制造业的中间体[45]，当部分印染废水、生活污水和加工制造业废水接入污水处理厂后，污泥EPS中多糖会通过吸附架桥的方式结合污水中小分子有机物，提高污泥EPS质量分数，从而促进AGS形成.
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表 2 EPS中有机组分分析(以峰面积计) Tab. 2 Analysis of organic components in EPS (peak area) |
1) 在接种污泥颗粒化期间，EPS中蛋白质质量分数明显提高，以TB-EPS层增加为主，由AS-WWTP的50.46 mg/g分别增加到AGS-LAB的83.14 mg/g和AGS-WWTP的102.99 mg/g.
2) 光谱分析结果表明，两种AGS的EPS中芳香族氨基酸、色氨酸/酪氨酸和天冬氨酸蛋白吸收峰强度明显提高，该部分蛋白质为AGS的形成奠定了物质基础.
3) 与接种污泥相比，两种AGS的EPS中含有较多疏水性氨基酸，带正电荷的碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)增幅较大，氨基酸总量平均提高50.15 mg/g.
4) 两种AGS的EPS中存在苯丙胺、羟基脲、二乙烯苯和十六甲基环八硅氧烷4种特有有机组分，推测该部分有机组分有助于缩短接种污泥颗粒化进程，提高AGS结构稳定性.
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