摘要
为了解决义齿口腔开放环境、血管支架类假体植入后可能带来的术后感染和炎症，本文基于Cu元素作为一种良好的广谱抗菌剂，结合激光选区熔化技术(SLM)的高自由成形度，在CoCrMoW合金中选择添加了不同比例的Cu元素(2%、4%、6%，质量分数)，开发出了力学性能优异且兼具抗菌性能的CoCrMoW-xCu合金。对比了CoCrMoW-xCu合金的显微组织、力学性能及抗菌行为，结果表明：Cu元素的引入对其物相种类影响不大，仍由高温γ-Co相和ε-Co相组成，Cu的引入抑制了高韧γ-Co向硬脆ε-Co相的马氏体转变，导致强硬度提升有限。通过CoCrMoW-xCu合金对金黄色葡萄球菌的抗菌测定，微小的α-Cu相有助于增强抗菌活性。优选综合性能良好的CoCrMoW-2Cu合金(抗拉强度为(1100±21.5) MPa，断后伸长率为9.5%±0.84%，抗菌率为34.75%)成分进行了SLM抗菌牙冠的仿形制造，为临床用SLM成形的抗菌植入体提供了强有力的理论基础和数据支撑。
关键词
Abstract
In order to solve the postoperative infection and inflammation that may arise from the implantation of prostheses such as dentures and vascular stents in an open oral environment, this study explores the use of Cu as a broad-spectrum antimicrobial agent combined with the high free formability of selective laser melting (SLM) technology.Different proportions of Cu elements (2wt.%, 4wt.%, 6wt.%) were selected and added to the CoCrMoW alloy to develop CoCrMoW-xCu alloy with excellent mechanical properties and antibacterial properties.The microstructure, mechanical properties and antibacterial behavior of CoCrMoW-xCu alloy were studied.The research results show that the introduction of Cu element has little effect on its phase type.Only because the introduction of Cu inhibits the martensitic transformation of high-tough γ-Co to hard and brittle ε-Co phase, the improvement of its strength and hardness is limited.Antibacterial assay of CoCrMoW-xCu alloy against Staphylococcus aureus, the tiny α-Cu phase contributes to enhanced antibacterial activity.Considering the mechanical and antibacterial properties comprehensively,the alloy composition of CoCrMoW-2Cu with good comprehensive properties(Rm=(1100±21.5) MPa,A=9.5%±0.84%,antibacterial rate 34.75%) was selected for profiling manufacturing of SLM antibacterial crowns.
钴（Co）基合金具有良好的耐腐蚀性、抗磨损及优异的力学性能，已在生物医学领域得到了广泛应用。钴基合金由于具有更高的弹性模量、强硬度而被广泛用于定制基台、牙冠、牙桥以及螺钉固位修复体等部位[1]。在传统基台、种植体制备过程中常需要针对定制化牙冠等复杂部件将钴基合金表面进行切削加工及表面精抛。但是，钴基合金在常温下一般是由面心立方结构（FCC）的高温γ-Co相和密排六方结构（HCP）的室温ε-Co相组成的双相结构，而具有HCP结构的ε-Co相由于具有较少的滑移系统，导致钴基合金在室温下的塑性变形能力较差。研究者为了获得较好的冷加工性，减少γ-Co相向ε-Co相的马氏体相变倾向，常在钴基合金中添加高达10wt.%的Ni元素以开发用于支架类产品的Co-Cr-W-Ni合金（ASTM F90合金或L605）[2-3]。但是具有复杂外形结构的个性化基台仍难以通过机加工的方式进行高效获取。因此，结合钴基合金的相变特性，探寻适于高性能钴基合金复杂构件的快速、精密一体化制造技术成为了现阶段亟需解决的问题之一。
利用增材制造技术制备陶瓷义齿尚处于新兴发展阶段，打印精度和制备部件的机械性能还有待提高，虽然增材制造陶瓷义齿在牙科修复体的制造中受到越来越多的关注，但离实际应用还有一定的距离[4]。激光选区熔化技术（Selective Laser Melting，SLM）是使用高能激光束以逐点扫描、逐层熔化的方式将金属粉末颗粒直接焊合到复杂部件中去的一种快速成形方法。由于具有可灵活制备结构复杂、体积小巧的个性化产品，SLM技术已被广泛应用于定制化医疗及钴基合金种植体的制造当中，在个性化义齿植入方面也有深入的应用[5-6]。然而，作为一种生物惰性材料，常用的钴基合金不具备杀菌能力，在种植体表面容易附着大量细菌，可能诱发严重的细菌感染。Zhang等[7]发现Cu2+使得ATP 合酶无法正常工作产生细菌生命活动所需能量从而杀死细菌。 Grass等[8]总结了合金中Cu的杀菌机理及过程。因此，为解决临床中细菌的感染问题，常采用物理/化学气相沉积[9-10]等表面改性的方法来阻止细菌对植入体表面的侵染。但是，表面改性涂层不仅表现出较差的结合强度，而且仅有微米级薄层可作为抗菌层，发挥抑菌效能的Cu2+离子含量微乎其微。为了攻克上述缺点，研究者已经通过添加Ag、Cu等抗菌剂进行了具有自抗菌特性的生物材料研究[11-12]。Zhang等[11]进一步证明含Cu量为2wt.%和4wt.%的CoCrMo合金对金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为 98.5%和99.6%。Wang等[13]发现含Cu的CoCrWNi合金对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出极佳的抗菌性能。此外，Ren等[14]通过研究发现，添加约3wt.%的Cu不仅保持了Co-Cr基合金的正常有益性能，而且还为CoCrCu合金提供了优异的抗菌和抗生物膜能力。
值得注意的是，现有研究更多的是偏重于Cu加入后其对细胞毒性等生物性能的影响[15-16]，而关于Cu对SLM成形的CoCrMoW钴基合金微观组织及力学性能的研究却鲜有报道。因此，本研究中拟采用SLM法制备不同Cu含量的CoCrMoW-xCu（x=0wt.%、2wt.%、4wt.%、6wt.%）合金，并进一步探究Cu含量对其微观组织、物相转变、力学性能及抗菌性能的影响机制，为CoCrMoW-xCu合金在口腔、血管支架等领域作为种植体材料的应用提供数据支撑及理论基础。
1 实验
1.1 实验材料及制备
增加Cu含量能提高杀菌率，但是过高的Cu含量对宿主细胞有毒性且降低合金的力学性能。将纯Cu粉末及广东省科学院新材料研究所自研CoCrMoW合金粉末利用机械球磨工艺混合调配，依次增加2wt.%，最大添加量为6wt.%进行混合。探究既能保证合金力学性能，同时又能提高抗菌性能的最优添加量，具体成分设计如表1所示。
表1CoCrMoW-xCu粉末的化学成分（质量分数/%）
Table1Chemical composition of CoCrMoW-xCu alloy powders (wt.%)
图1（a）、（c）为CoCrMoW合金与纯Cu的混合粉末形貌图，由于熔炼过程中CoCrMoW或Cu液滴会发生相互碰撞，有少量卫星球粘附于粉体表面的现象。依据GB/T19077标准，使用Mastersizer 2000激光衍射颗粒分析仪进行测量，粒径分布如图1（b）所示，Cu粉末粒径DV（10）=16.1 μm，DV（50）=20.3 μm，DV（90）=49.5 μm。机械球磨后粒径分布范围为DV（10）=16.1 μm，DV（50）=29.0 μm，DV（90）=58.2 μm，符合SLM对粉末粒径的分布要求（图1（d））。
采用广东省科学院新材料研究所自主研发的激光3D打印设备（GDINM-D150）成形CoCrMoW-xCu试样（图1（e）），SLM实验基板选用316L不锈钢，样品制备前将基板预热至100℃，成形仓中充入高纯氩气（99.999vol.%）以保证打印过程中的氧含量维持在0.1vol.%以下。采用图1（f）所示的“之字形”扫描策略依次熔化粉末金属层（层间旋转角度为67°），以减小SLM成形过程中的热量累积，避免开裂。选用的SLM成形工艺参数为：层厚30 μm，扫描搭接60 μm，激光功率165 W，扫描速度1 050 mm/s，并成形出一系列不同Cu含量的立方体样品（尺寸为10 mm×10 mm×6 mm）以用于微观检测和抗菌测试，拉伸试样的尺寸为73 mm×11 mm×3.5 mm，图1（f）仅展示了部分用于上述检测的典型SLM CoCrMoW-xCu样品。
图1原料与样品成形：（a）Cu粉末形貌；（b）Cu元素分布情况；（c）CoCrMoW-xCu粉末形貌；（d）粉末混合后粒径分布；（e）SLM成形装置的外部；（f）扫描策略和成形试样
Fig.1Raw materials and sample forming: (a) Morphology of the Cu powders; (b) Cu powders; (c) morphology of the CoCrMoW-xCu powders; (d) particle size distribution; (e) exterior of the SLM forming apparatus; (f) scanning strategy and typical SLM samples
1.2 微观组织与力学性能测试
依次用目数由低到高的砂纸对CoCrMoW-xCu立方体样品进行打磨，打磨到2 000#砂纸后采用TegraMin-25型自动研磨机将其抛光至镜面效果后，使用Leica DmirmMW550型光学显微镜（OM）确认样品无明显划痕。遴选部分CoCrMoW-xCu样品应用Smartlab9 KW型高分辨X射线衍射仪进行物相测试，扫描角度为30°~90°。其余部分CoCrMoW-xCu样品使用王水（硝酸∶盐酸=1 mL∶3 mL）作为腐蚀液进行样品腐蚀，腐蚀时间20 s左右。之后，使用Nova nanoSEM430型扫描电子显微镜（SEM）对CoCrMoW-xCu试样进行微观组织观测及能谱分析（EDS）。
将CoCrMoW-xCu试样的硬度测试面抛光至Ra小于0.15 μm后，使用显微硬度计（Struers DuranScan 70 G5型，奥地利）对试样进行维氏显微硬度表征，加载载荷2 N，保载时间25 s，进行5次硬度测量并取其平均值。拉伸测试是根据ASTM E8-08/E8M-16a标准，使用Instron 5982万能拉伸试验机对CoCrMoW-xCu试样进行拉伸性能测试，并对拉伸试样进行SEM断口形貌分析。
1.3 抗菌性能表征
使用平板涂布计数法进行抗菌性能测试，用LB 液体培养基将金黄色葡萄球菌菌液稀释至106 CFU/mL。向SLM CoCrMoW-xCu试样样品表面滴加50 μL 稀释后的菌液，对照组不加样品，用覆盖膜覆盖并轻轻按压，放于恒温培养箱中37℃静置培养18 h。培养完成后，用2 mL无菌PBS冲洗，并用PBS溶液做连续10倍稀释，取100 μL稀释液均匀涂布于LB固体培养基上。放于37℃恒温培养箱中培养18 h，取出拍照并记录菌落数，之后根据GB4789.2-2016进行菌落计数并计算抗菌率。
2 结果与分析
2.1 物相分布
图2为CoCrMoW-xCu样品的XRD衍射谱图。可见，不同Cu含量的CoCrMoW-xCu样品的物相均只由FCC结构的高温γ-Co相和HCP结构的低温ε-Co相组成，即使是添加了6wt.%Cu的SLM CoCrMoW-6Cu样品中也未检测到Cu峰。这是因为尽管α-Cu在1 367℃时在钴基合金中的最大固溶度可达20.9wt.%，但其在室温下几乎不溶于钴基合金，Co和Cu之间也不存在金属间化合物[17]。因此，α-Cu相更多的是以中间相的形式从室温析出并分布CoCrMoW合金中，所以很难在XRD中找到对应的峰位。此外，随着Cu含量的增高，ε-Co（101）的峰位越来越低，表明α-Cu对高温γ-Co相向ε-Co相的马氏体转变是有明显抑制作用的，这也将进一步影响CoCrMoW-xCu的微观组织及相应的力学性能。
图2磁畴量子点阵列组成的逻辑信号及器件[48]
Fig.2XRD spectrums of SLM CoCrMoW-xCu samples
2.2 微观组织演化
Cu含量对CoCrMoW合金微观组织的影响如图3所示。图3（a）展示了CoCrMoW样品不同截面腐蚀后的金相照片，可以看出，XY表面熔道宽度约为50 μm，基本与所用的激光光斑一致。此外，由于熔化效果较好，只有YZ侧面看到了少许未熔颗粒（图3（a）中的红色箭头所示）存在于鱼鳞状的熔池底部，表明在激光熔化过程中仍会存在粉末床无法完全熔透的现象。在不含Cu的CoCrMoW样品中可以看到微观组织主要是由细小的柱状晶构成，其生长方向是由熔池底部向熔池中部生长（图3（a）及（b）中的蓝色箭头所示），且随激光扫描方向的移动而有所偏移。熔池中由于散热方向较为均匀，因此熔池中部的组织主要由等轴晶构成（图3（b）中绿色箭头所示）。
通过XRD的表征可知，由于SLM成形冷速极快（约103~106 K/s），导致SLM CoCrMoW试样中主要是由FCC结构的高温γ-Co相组成，但也有少量的ε-Co相存在，这一部分ε-Co相的形成是由于SLM扫描过程中固有的自回火效应导致ε-Co相通过绝热马氏体转变而来的[18]，最终形成了以高温γ-Co相树枝状晶为主、等轴晶为辅的微观组织（图3（a）、（b））。
图3腐蚀后CoCrMoW-xCu样品的微观组织：（a）CoCrMoW合金的OM图；（b）~（e）CoCrMoW、CoCrMoW-2Cu、CoCrMoW-4Cu及CoCrMoW-6Cu样品的SEM图；（f）图（e）的EDS面扫结果
Fig.3Microstructure of CoCrMoW-xCu samples: (a) OM of CoCrMoW samples; (b-e) SEM of CoCrMoW with 0Cu, 2Cu, 4Cu and 6Cu, respectively; (f) EDS of fig.3 (e)
图3（c）~（f）分别为不同Cu含量的CoCrMoW-xCu合金的微观组织形貌及主要元素分布情况，可以看出，Cu元素的加入对CoCrMoW合金组织的影响并不明显，仍是以柱状树枝晶为主，少量的等轴晶存在于熔池内部。但由于Cu和钴基合金的流体粘度不同，图3（c）~（e）中在激光熔池的扫描前端出现了回流现象（如黑色箭头所示），图3（f）中的能谱分析也证明了Cu元素富集在了扫描前端处的熔池区域。此外，Cu元素除了在熔池前端有富集外，更多的是均匀分布在枝晶组织中，并未形成偏聚等现象，原因是随着温度降低，低温下Cu元素在Co和Cr中的溶解度较低，会以α-Cu相的形式从基体中析出，但是Cu的弥散析出反应是在固态下进行的，因此Cu沉淀物会较为细小。
通过对CoCrMoW-xCu样品物相及微观组织的分析及表征，结合图4（a）中的Co-Cu二元相图可以绘制出图4（b）所示的Cu对CoCrMoW-xCu合金微观组织形成及凝固行为的影响机制。CoCrMoW-xCu合金在快速凝固时经历了2个典型阶段：第I阶段，Co基合金的熔点要比Cu熔点高，因此在1 495℃时将沿着激光扫描方向（图4（b）中的箭头V）优先形成大量的高温γ-Co枝晶，而熔化的α-Cu相则固溶在Co基组织中；第II阶段，随着熔池快速凝固和SLM反复扫描带来的原位自回火效应，出现了高温γ-Co相→室温ε-Co相的转变，但是由于该绝热马氏体转变是在固相反应中发生的且转变速率较慢，因此γ-Co柱状枝晶仍然是CoCrMoW-xCu合金中的主要构成相。随着Cu含量的增加，一方面析出的纳米Cu消耗了大量能量，另一方面，ε-Co相主要是在γ-Co枝晶内部的高能堆垛层错处形成的，适合的形核位点较少，因此转变的γ-Co相仅以细长条状存在于高温γ-Co相的枝晶内部，即如图4（b）所示。
Fig.4(a) Co-Cu phase diagram[17-18] and (b) melt flow behavior and microstructural evolution of CoCrMoW-xCu samples
2.3 力学性能
义齿材料力学性能需要与人骨组织匹配，同时要满足术后的使用要求。表2及图5统计了CoCrMoW-xCu合金的力学性能和抗拉强度-显微硬度间的模型关系。可以看出，当添加的Cu含量较少时，如CoCrMoW-2Cu试样的断后伸长率没有降低的前提下（A=9.5%），强硬度均有小幅提升（屈服强度从（739±11.6）MPa提高至（768±11.2）MPa，硬度从（383.6±25.6）HV0.2提高到了（389.0±31.2）HV0.2）；但是当Cu含量不断增加时，不仅塑韧性大幅下降至CoCrMoW-6Cu试样的5.0%±0.78%，屈服强度下降至（677±8.2）MPa，硬度也降低到了（355.4±21.6）HV0.2。这是由于Cu的添加一方面降低了脆硬ε-Co相的含量，另一方面在晶界和晶粒内部析出了硬度较软的α-Cu相，导致其强度、硬度均有所下降。
表2CoCrMoW-xCu合金的力学性能.
Table2Mechanical properties of CoCrMoW-xCu alloy samples
图5CoCrMo-xCu合金样品的工程应力-应变曲线（a）及拉伸强度-显微硬度间的相互关系（b）
Fig.5(a) Engineering stress-engineering strain curves and (b) relationship between tensile strength and microhardness of CoCrMo-xCu samples
但是在适当添加Cu（如：2wt.% Cu）时，大量的Cu元素以固溶体形式存在于γ-Co中，对钴基合金起到了很好的固相强化作用，而且Cu作为一种延展性较好的材料，也促进其韧性没有明显降低。因此，在Cu含量为2wt.%时的屈服强度和硬度均得到了较好提升。进一步地对CoCrMoW-xCu合金抗拉强度（Rm）及显微硬度（HV）间的关系进行拟合，结果如图5（b）所示，即Rm=7.82HV-1 929.25（R2=0.97），为Cu含量对CoCrMoW-xCu合金抗拉强度-显微硬度的影响建立了一个较好的预测模型。
图6（a）~（h）分别展示了CoCrMoW-xCu样品的宏观断口形貌及相应放大图。尽管CoCrMoW-xCu样品中仍多以滑移系多、塑韧性较好的高温γ-Co相为主，但是滑移系少且变形困难的ε-Co相提高了材料脆性，导致断口处仅有轻微的“颈缩”现象（黑色箭头所指）可以被观察到。
图6SLM CoCrMoW-xCu试样的断口形貌：（a）CoCrMoW试样；（b）图（a）中的断口放大图；（c）CoCrMoW-2Cu试样；（d）图（c）中的断口放大图；（e）CoCrMoW-4Cu试样；（f）图（e）中的断口放大图；（g）CoCrMoW-6Cu试样；（h）图（g）中的断口放大图
Fig.6Fracture morphology of SLM-fabricated CoCrMoW samples with different Cu contents: (a) CoCrMoW samples; (b) magnified view of fig.6 (a) ; (c) CoCrMoW-2Cu samples; (d) magnified view of fig.6 (c) ; (e) CoCrMoW-4Cu samples; (f) magnified view of fig.6 (e) ; (g) CoCrMoW-6Cu samples; (h) magnified view of fig.6 (g)
随着Cu含量的增高，如图6（a）~（h）所示，断口形貌从不含Cu的撕裂脊（绿色箭头所指）及解理平面的脆性断裂特征，逐渐出现了有少量韧窝（图6（h）中蓝色箭头所示）的韧性断裂特征，尽管其韧性没有得到显著提升，但已展现出了脆/韧性断裂的混合特征，表明Cu含量的不断提高在抑制ε-Co硬脆相转变的同时，对CoCrMoW合金有着改善韧性的良好作用。另外，值得注意的是由于SLM属于微熔池冶金过程，尽管经过多次参数优化后仍会有少量未熔颗粒无法被熔化，如CoCrMoW-2Cu样品的断口形貌（图6（d）紫色箭头）所示，形成的孔洞等缺陷将会大幅削弱其力学性能。
2.4 抗菌行为及齿科应用
表3及图7、图8展示了SLM CoCrMo-xCu样品对金黄色葡萄球菌的抗菌能力。
表3CoCrMo-xCu 样品对金黄色葡萄球菌的抗菌率
Table3Antibacterial rate of SLM CoCrMo-xCu samples against staphylococcus aureus
当Cu添加量为2wt.%时，其抗菌率由6.38%显著提高至34.75%，抗菌能力提高了444.67%；当Cu含量进一步提高至4wt.%后，其抗菌能力比CoCrMo-2Cu样品提高了59.19%，增加至6wt.%Cu含量后的抗菌提高率仅比SLM CoCrMo-4Cu样品提高了5.77%。可以看出，随着铜含量提高，固溶在钴基合金内部的少量α-Cu将持续释放，抗菌率也将随之提高，具体地，抗金黄色葡萄球菌率（A，%）与含铜量（B，%）间的关系可以由图8所示进行拟合，即：
图7培养18 h后CoCrMo-xCu样品中的菌落数
Fig.7Number of colonies in SLM CoCrMo-xCu samples after 18 h of incubation
图8培养18 h后CoCrMo-xCu含铜量与抗金黄色葡萄球菌率间的关系
Fig.8Relationship between copper content in CoCrMo-xCu and resistance to staphylococcus aureus after 18 h culture
综合考虑力学性能及抗菌效能等多重因素的影响，最终优选出力学性能优秀（抗拉强度=（1 100±21.5）MPa，断后伸长率=（9.5±0.84）%）且兼具优异抗菌效果（抗金黄色葡萄球菌率=34.75%）的CoCrMoW-2Cu组分进行了抗菌牙冠的SLM仿形制造，制备后的成品如图9所示，通过陶瓷上釉后具有良好的金瓷结合强度（平均金瓷结合力达44.55 MPa，金属离子释放率小于0.38 μg/cm2），可满足义齿的植入要求。
图9SLM成形CoCrMo-2Cu抗菌牙冠：（a）牙冠外观形貌；（b）牙冠与牙床匹配性；（c）牙冠表面烤瓷
Fig.9CoCrMo-2Cu antibacterial crown formed by SLM: (a) appearance of the crown; (b) matching of crown and gums; (c) porcelain on the crown surface
3 结论
考虑口腔领域的开放式植入环境可能带来的细菌感染等问题，本研究基于SLM技术探究了不同Cu含量对CoCrMoW合金力学性能及抗菌能力的影响机制，优选出抗菌、力学性能优异的CoCrMoW-2Cu合金并进行了个性化抗菌牙冠的一体化制造，获得如下结论。
1）当Cu含量添加少于6wt.%时，SLM CoCrMoW-xCu样品中的物相仍只由FCC结构的高温γ-Co相和HCP结构的低温ε-Co相组成，并未检测到α-Cu相。
2）SLM CoCrMoW-xCu样品中的微观组织主要是由强韧性较好的γ-Co柱状树枝晶、细小的硬脆ε-Co相及纳米α-Cu相为主，Cu的加入对其微观组织形貌影响较小，仅在熔池前端存在Cu熔体的回流现象。
3）Cu含量在2wt.%时的力学性能（抗拉强度=（1 100±21.5）MPa，断后伸长率=（9.5±0.84）%）较好，随着Cu含量不断增加，其抗金黄色葡萄球菌的功效也随之提高（在6wt.%时可达58.51%），综合考虑力学及抗菌性能，优选CoCrMoW-2Cu合金进行了SLM抗菌牙冠的仿形制造。
